1561年在果阿晋升为司铎，以语言及写作方面的能力见长，从事与各传教地通讯的工作。
1562年在肥前横瀬浦登陆，开始在当地从事传教工作。
在学习掌握了日语后，1564年从平户前往京都。
1565年1月31日抵达京都，但是对于将军足利义辉与室町幕府威信的旁落感到非常失望。
在混乱的战国时代艰困的在京都、近畿地区负责传教的工作也并不顺利。
然而转机很快到来，1569年近幾新的掌控者织田信长在正在建设中的二条城召见了弗洛伊斯。
经历了火烧比叡山以及声势浩大的织田包围网，织田信长对既存的佛教非常反感，尤其是一向宗。
但是信长对于新鲜南蛮事物非常感兴趣。
交流很愉快，弗洛伊斯得到织田信长的信任，被准许在畿内传教。
弗洛伊斯与1570年来日的意大利传教士一起在京都进行传教活动，得到许多信徒。
弗洛伊斯在其著作中曾提到织田信长虽是异教徒，但是对于基督教始终抱着宽容的态度（弗洛伊斯的著作有着许多《信长公记》没有的记述，是研究日本史的重要资料之一）。
1577年弗洛伊斯将京都地区传教负责人的职位让出，随即来到丰后担任地区负责人的职务，在大友氏领内从事传教事业。
赴任后，与大友宗麟、义统父子成为亲交。
1580年传教士范礼安来日时陪同担任翻译，在安土城拜谒织田信长。
1583年，由于上级指示离开了第一线的传教工作，开始记录耶稣会在日本的活动，执笔《耶稣会日本年报》；后来将精力投入在记录日本各地的见闻上，开始《日本史》的编纂。
织田信长在本能寺之变被杀后，丰臣秀吉一开始为继承了织田大魔王对耶稣会宽容的政策，但是当基督教信徒越来越多，势力一点点扩大后，丰臣秀吉开始感到不安。
于是在1587年6月19日豊臣秀吉发布《伴天连追放令》，命令耶稣会传教士立即停止传教，并且必须在20日内离开日本本土。
最后竟然捣毁了京都等地的教堂。
无奈弗洛伊斯只能来到长崎定居。
1590年，弗洛伊斯偕同归国的天正遣欧少年使节及范礼安在聚乐第会见了丰臣秀吉。
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